El consultorio biomédico de Khram Cuervo Errante

[Khram Cuervo Errante]

Ehm... verás... el LacZ no te sirve. Todos los lactobacillus metabolizan lactosa y no te sirve como selector.

Eso de que no serían aprobadas por comités éticos, habría que verlo.

De todos modos, olvídate del fago. Es más fácil transformar la bacteria con un plásmido que lleve el mismo lacZ. Aunque tendrías que buscar otro selector que te valga con lactobacillus...

[Rohi]

Como sabes tengo alergia que ya estoy contento de como me están tratando (me han dado un antihsitaminico en forma de liofilizado de los buenos, no el engañabobos de antes) y en un mes me hacen una analítica completa para considerar si el año que viene me vacunan, etc etc.

El caso es que ayer volviendo en coche me costaba respirar, me empecé a poner nervioso, y acabé en el ambulatorio dónde me hicieron un electro (todo bien) y me enchufaron dos diazepanes para calmarme (soy un tipo grande).

Tengo otro diazepan de reserva que me dieron, y a parte mi madre tiene por ahí pastillas Enrelax (ya tu sabe, valeriana, todo natural).

Aún me noto un poco nervioso (las típicas crisis de ansiedad que se desarrollan por miedo a sufrir una crisis de ansiedad, qué putas) Qué me recomiendas, que me vaya tomando un par de tilitas para ir light o que me vaya metiendo las pastillas enrelax? Ahora mismo me estoy haciendo un par de infusiones Infurelax, a ver si surte efecto.

[Khram Cuervo Errante]

¿Recomendarte? Tírate en el sofá, échate diez minutos y verás cómo se te pasa todo.

Y si no, empieza con la tila.

[Watta]

Ehm... verás... el LacZ no te sirve. Todos los lactobacillus metabolizan lactosa y no te sirve como selector.

Eso de que no serían aprobadas por comités éticos, habría que verlo.

De todos modos, olvídate del fago. Es más fácil transformar la bacteria con un plásmido que lleve el mismo lacZ. Aunque tendrías que buscar otro selector que te valga con lactobacillus...

La gracia está en que algunos no la podrán metabolizar porque su gen LacZ se verá interrumpido al producirse la doble recombinación e incorporar la enzima de interés, siendo estos últimos los que queremos seleccionar.

El problema del plásmido es que al no existir ningún tipo de presión selectiva nadie me aseguraría su presencia en generaciones posteriores. Si induzco una doble recombinación por homologia en el genoma, evidentemente la descendencia poseerá esa información genética codificante para la enzima que quiero.

[Khram Cuervo Errante]

A ver, que te estás liando, Watta.

TODOS los lactobacillus pueden metabolizar lactosa. No vas a poder romper el LacZ de la bacteria propia. No vas a poder meter el gen en el genoma completo de la bacteria. Lo que haces con el fago es nada más y nada menos que meter un plásmido.

Tienes que encontrar un selector válido para lactobacillus que te permita usar un plásmido. La recombinación homóloga que propones no te va a dar resultado por mucho que intentes hacerlo con un fago porque para eso necesitas una cepa recombinante de lactobacillus y, para lograrlo, además necesitas conferirle la capacidad de recombinar, algo que harás con un plásmido.

Es decir, que no quieres meter un plásmido (vaya usted a saber por qué), pero sin embargo tienes que meter otro para que la bacteria recombine el gen que tú quieres en el lugar que tú quieres.

Creo que lo estás liando demasiado. Si tú inoculas lo que sea con una bacteria transformada, lo único que habrá es bacteria transformada. Los plásmidos no se pierden porque sí.

De todos modos, aún no veo la totalidad del problema. ¿Qué es lo que quieres conseguir?

[Rohi]

No entiendo por qué se dice que cuando en la recombinación la porción basal es la que rota no se produce recombinación aunque se forme heteroduplex. En el dibujito se ve como cada hebra tiene una porción de la otra, cómo que no han recombinado? :S

Vale, creo que lo acabo de ver, sólo tiene un cacho de la otra hebra en una de las suyas y no en las dos.

[Khram Cuervo Errante]

Bien visto.

[Watta]

A ver, que te estás liando, Watta.

TODOS los lactobacillus pueden metabolizar lactosa. No vas a poder romper el LacZ de la bacteria propia. No vas a poder meter el gen en el genoma completo de la bacteria. Lo que haces con el fago es nada más y nada menos que meter un plásmido.

¿Y no hay forma de inducir que ese gen, en lugar de "quedar" como plásmido, recombine con el genoma de la bacteria y se integre en el mismo?

Tienes que encontrar un selector válido para lactobacillus que te permita usar un plásmido. La recombinación homóloga que propones no te va a dar resultado por mucho que intentes hacerlo con un fago porque para eso necesitas una cepa recombinante de lactobacillus y, para lograrlo, además necesitas conferirle la capacidad de recombinar, algo que harás con un plásmido.

No entiendo qué es un "selector válido". Entiendo, no obstante, que para poder inducir esa doble recombinación antes debo lograr que mi cepa de Lactobacillus sea recombinante, cosa que lograría con un plásmido (¿son los llamados Hfr?).

Es decir, que no quieres meter un plásmido (vaya usted a saber por qué), pero sin embargo tienes que meter otro para que la bacteria recombine el gen que tú quieres en el lugar que tú quieres.

Creo que lo estás liando demasiado. Si tú inoculas lo que sea con una bacteria transformada, lo único que habrá es bacteria transformada. Los plásmidos no se pierden porque sí.

Es decir, necesito introducirle un plásmido que le permita poder llevar a cabo una doble recombinación. No queríamos meterle el plásmido que codificara para el gen porque nada me aseguraría que ese plásmido iba a pasar de una generación a otra al no existir ninguna presión selectiva sobre "la capacidad para degradar celulosa", de modo que habría el riesgo de perder esa información al encontrarse en un plásmido. De integrarla directamente en el genoma, no podría perderse.

De todos modos, aún no veo la totalidad del problema. ¿Qué es lo que quieres conseguir?

Queremos lograr Lactobacillus que sean capaces de degradar la celulosa mediante una enzima celulolítica que nosotros introduciremos en nuestras cepas de Lactobacillus mediante una infección por fago específico de Lactobacillus.

Fago modificado que contiene gen que codifica para la enzima celulolítica + Lactobacillus = Lactobacillus de interés con enzima celulolítica.

Problema: Cómo lograr que la información que codifica para la enzima celulolítica perdure en la bacteria y las posteriores generaciones para siempre.

Solución: Integrar el gen que codifica para la enzima celulolítica, no en forma de plásmido, sino en su genoma. ¿Cómo? Habíamos pensado eso de la doble recombinación, que al parecer no entendí muy bien :S

Evidentemente te preguntarás qué coño pinta el gen lacZ aquí. Pues bien, nuestra intención era utilitzarlo como indicador de aquellas bacterias que han incorporado el gen de interés: si añadimos secuencias homólogas a las secuencias de los extremos del gen lacZ en los extremos del gen que codifica para la enzima celulolítica, se produciría un apareamiento por homologia entre las regiones que comprenden los extremos del gen LacZ con los extremos del gen celulolítico, de modo que por doble recombinación los genes "quedarían intercambiados", codificando el Lactobacillus para la enzima celulolítica y quedando interrumpido su gen LacZ. Matamos dos pájaros de un tiro: logramos integrar la información para que codifique para la enzima y nos servimos de su no-capacidad para degradar la lactosa para seleccionarlos con respecto a aquellos que sí degradan la lactosa (y que por tanto no han incorporado el gen que nos interesa). Evidentemente, nos quedamos con los que no pueden degradar la lactosa, los multiplicamos y tenemos cantidades industriales de Lactobacillus degradadores de celulosa en nuestro haber

[Leinster]

Duda khram, hoy charlando con un colega sobre otro colega (y lo enórmemente fuerte que se está poniendo tras dos años de gimnasio xD) acabó la cosa derivando a la hinchazón que tienen los niños de áfrica en el estómago.
La cosa es que a mí me dijeron que es porque el cuerpo recurre a las proteínas como combustible metabólico como uno de sus últimos recursos, y que lo del estómago era debido a que se consumían los músculos del abdomen que sujetaban el estómago, lo que hacía que este se quedase "colgando"
Según mi amigo en cambio, es por retención de líquidos.

La opción correcta es la A, la B, AB o ninguna? 

[Khram Cuervo Errante]

@Watta: Si la idea del LacZ está muy bien. Pero Lactobacillus deficientes en LacZ no existen. Ni lo vas a conseguir a menos que les metas un Hfr, como tú bien dices, para poder lograr que recombinen de alguna manera. Así que tu método tiene 3 problemas básicos:

1.- Encontrar un fago que infecte Lactobacillus, que ya es complicado.
2.- Que ese fago se integre en el genoma de Lactobacillus, algo más complicado aún.
3.- Que ese Lactobacillus tenga capacidad recombinante, que ya es lo más...

Tal como yo lo veo, tienes que introducir un plásmido, el Hfr, lo que abre la puerta a que tus Lactobacillus transfieran el plásmido a otras bacterias que formen parte de la microbiota normal, con lo que, además, abres la puerta a que la resistencia a antibióticos se transfiera a otras bacterias u otros plásmidos.

Así que la solución es encontrar una cepa de Lactobacillus Hfr^-, que es bastante fácil de encontrar. Esta cepa ni recombina, ni transfiere plásmidos. Y transformar una bacteria así (ojo, digo transformar) mediante CaCl₂, electroporación o lo que sea es factible.

Ahora bien, no hay presión ambiental para que lo conserve. Te diré que si tú metes una cepa con el plásmido, esa cepa no va a perder el plásmido aunque no lo use. El plásmido también se copia y pasa a las células hijas. De todos modos, puedes meterle dos insertos: uno que lleve tu celulasa y otro que responda a presión ambiental, como resistencia a ambientes ácidos o algo que se te ocurra. Sólo necesitas un plásmido que tenga dos sitios de clonaje para enzimas de restricción distintas. Es tan fácil como eso. Puedes diseñar un plásmido con dos polylinker o un polylinker con sitios de corte alejados para dos enzimas de restricción distintas (como BamHI y SwaI). Así, primero insertas tu celulasa con BamHI y luego tu gen de resistencia con SwaI (o al revés). Con eso tienes un plásmido que te asegura permanencia y producción de proteína.

Con lo de "selector válido" me refería a algo que te indique que tus colonias llevan el plásmido. El LacZ en Lactobacillus no lo es porque NO HAY NINGUNA CEPA DE LACTOBACILLUS QUE SEA Lac^-. Por mucho que lo recombines, no vas a poder recombinarlo en su operón Lac...

@Leinster: son ambas. La acumulación de líquido la provoca la digestión de proteína. Se llama ascitis.