El consultorio biomédico de Khram Cuervo Errante

[Watta]

@Watta: Si la idea del LacZ está muy bien. Pero Lactobacillus deficientes en LacZ no existen. Ni lo vas a conseguir a menos que les metas un Hfr, como tú bien dices, para poder lograr que recombinen de alguna manera. Así que tu método tiene 3 problemas básicos:

1.- Encontrar un fago que infecte Lactobacillus, que ya es complicado.
2.- Que ese fago se integre en el genoma de Lactobacillus, algo más complicado aún.
3.- Que ese Lactobacillus tenga capacidad recombinante, que ya es lo más...

Tal como yo lo veo, tienes que introducir un plásmido, el Hfr, lo que abre la puerta a que tus Lactobacillus transfieran el plásmido a otras bacterias que formen parte de la microbiota normal, con lo que, además, abres la puerta a que la resistencia a antibióticos se transfiera a otras bacterias u otros plásmidos.

Empezaré por el principio porque probablemente lo que sucede es que tengo carencias en el conocimiento base, así que pregunto:

¿Se puede inducir una recombinación por homologia, cierto?

secuencia 1: AAACAAC - gen guapo - TTAGGGA

Si introduzco una secuencia 2: TTTGTTG - gen feo - AATCCCT en el microorganismo con la secuencia 1, ¿no se producirá apareamiento por homologia? ¿no podría producirse luego una doble recombinación de modo que la secuencia 1 pasara a ser?:

secuencia 1: AAACAAC - gen feo - TTAGGGA

Y la secuencia 2,

secuencia 2: TTTGTTG - gen guapo - AATCCCT

Así que la solución es encontrar una cepa de Lactobacillus Hfr^-, que es bastante fácil de encontrar. Esta cepa ni recombina, ni transfiere plásmidos. Y transformar una bacteria así (ojo, digo transformar) mediante CaCl₂, electroporación o lo que sea es factible.

Ahora bien, no hay presión ambiental para que lo conserve. Te diré que si tú metes una cepa con el plásmido, esa cepa no va a perder el plásmido aunque no lo use. El plásmido también se copia y pasa a las células hijas. De todos modos, puedes meterle dos insertos: uno que lleve tu celulasa y otro que responda a presión ambiental, como resistencia a ambientes ácidos o algo que se te ocurra. Sólo necesitas un plásmido que tenga dos sitios de clonaje para enzimas de restricción distintas. Es tan fácil como eso. Puedes diseñar un plásmido con dos polylinker o un polylinker con sitios de corte alejados para dos enzimas de restricción distintas (como BamHI y SwaI). Así, primero insertas tu celulasa con BamHI y luego tu gen de resistencia con SwaI (o al revés). Con eso tienes un plásmido que te asegura permanencia y producción de proteína.

Es decir, que si lo que te estoy contando yo es una tontería, tendríamos esta opción como válida.

Con lo de "selector válido" me refería a algo que te indique que tus colonias llevan el plásmido. El LacZ en Lactobacillus no lo es porque NO HAY NINGUNA CEPA DE LACTOBACILLUS QUE SEA Lac^-. Por mucho que lo recombines, no vas a poder recombinarlo en su operón Lac...

A esto ya me habrás respondido cuando respondas a mi ejemplo de secuencia 1 y secuencia 2

Bueno, sea lo que sea, muchísimas gracias Khram. Hoy se lo comentaré a los compañeros del trabajo, a ver qué me dicen.

[Khram Cuervo Errante]

Empezaré por el principio porque probablemente lo que sucede es que tengo carencias en el conocimiento base, así que pregunto:

¿Se puede inducir una recombinación por homologia, cierto?

secuencia 1: AAACAAC - gen guapo - TTAGGGA

Si introduzco una secuencia 2: TTTGTTG - gen feo - AATCCCT en el microorganismo con la secuencia 1, ¿no se producirá apareamiento por homologia? ¿no podría producirse luego una doble recombinación de modo que la secuencia 1 pasara a ser?:

secuencia 1: AAACAAC - gen feo - TTAGGGA

Y la secuencia 2,

secuencia 2: TTTGTTG - gen guapo - AATCCCT

Esto estaría bien si las bacterias sufrieran recombinación PERO NO LO HACEN. De ahí que se las denomine clones. Si tú estuvieras trabajando con eucariotas entonces sí. Pero si para que la bacteria recombine tienes que meterle un plásmido que es el Hfr, ¿por qué no te ahorras tiempo, esfuerzo, dinero y sucesos estocásticos y le metes un plásmido y  ya?

[Watta]

Empezaré por el principio porque probablemente lo que sucede es que tengo carencias en el conocimiento base, así que pregunto:

¿Se puede inducir una recombinación por homologia, cierto?

secuencia 1: AAACAAC - gen guapo - TTAGGGA

Si introduzco una secuencia 2: TTTGTTG - gen feo - AATCCCT en el microorganismo con la secuencia 1, ¿no se producirá apareamiento por homologia? ¿no podría producirse luego una doble recombinación de modo que la secuencia 1 pasara a ser?:

secuencia 1: AAACAAC - gen feo - TTAGGGA

Y la secuencia 2,

secuencia 2: TTTGTTG - gen guapo - AATCCCT

Esto estaría bien si las bacterias sufrieran recombinación PERO NO LO HACEN. De ahí que se las denomine clones. Si tú estuvieras trabajando con eucariotas entonces sí. Pero si para que la bacteria recombine tienes que meterle un plásmido que es el Hfr, ¿por qué no te ahorras tiempo, esfuerzo, dinero y sucesos estocásticos y le metes un plásmido y  ya?

La idea es introducir el plásmido (con Hfr + gen de interés) de modo que:
1- Pueda recombinar gracias al hecho de ser Hfr
2- El gen de interés, gracias a homologia de sus extremos con extremos de gen lacZ, interrumpa al gen lacZ en producirse la doble recombinación, codificando entonces para nuestra enzima celulolítica.

Esto no lo veo para nada descabellado...

En cuanto a tu idea de añadirle un gen de "resistencia ácida", por ejemplo, no nos serviría: los lactobacillus no modificados también son resistentes a las condiciones ácidas, de modo que no se produciría ningún tipo de selección real. Además, trabajaremos probablemente sobre pH neutros ya que lo hemos enfocado a nivel de duodeno y no de estómago

[Khram Cuervo Errante]

Entonces, está mal planteado el asunto desde el inicio porque necesitas:

1.- Una forma de que la bacteria recombine.
2.- Una forma de seleccionar la bacteria recombinante.

El primer paso está claro: un Hfr. Para ello, necesitas meter el plásmido correspondiente al Hfr y después UN CROMOSOMA BACTERIANO homólogo al de tu especie hospedadora. Es decir, que necesitas meter dos fragmentos de ADN en la bacteria: uno para que la recombinación se pueda producir y otro que sería el ADN donador, que debería ser TOTALMENTE HOMÓLOGO al de tu bacteria.

Vamos que tendrías que transformar la bacteria dos veces.

Pero vamos a probar con un fago. Un fago que infecte tu bacteria. Y que además sea de los que insertan el ADN en el cromosoma bacteriano. ¿Dónde se va a insertar? Buena pregunta. ¿Y si se carga la bacteria sólo con eso porque se inserta en un sitio crucial?

Da igual, en alguna se insertará en un buen sitio para que la bacteria sobreviva. Vamos, que en una placa te crecerán tanto las bacterias infectadas como las que no lo están. ¿Cómo seleccionas las que lo están?

El LacZ está muy bien para bacterias Lac⁺... en un principio. Porque no se te va a insertar el fago ahí por mucho que tú quieras. A menos que lo hagas con un plásmido.

Es decir, que si quieres usar el LacZ de la bacteria, no vas a conseguir recombinar. Y si no recombina, vas a tener que usar un plásmido. Lo tienes jodido...

[Watta]

Entonces, está mal planteado el asunto desde el inicio porque necesitas:

1.- Una forma de que la bacteria recombine.
2.- Una forma de seleccionar la bacteria recombinante.

Exacto, eso necesitamos.

El primer paso está claro: un Hfr. Para ello, necesitas meter el plásmido correspondiente al Hfr y después UN CROMOSOMA BACTERIANO homólogo al de tu especie hospedadora. Es decir, que necesitas meter dos fragmentos de ADN en la bacteria: uno para que la recombinación se pueda producir y otro que sería el ADN donador, que debería ser TOTALMENTE HOMÓLOGO al de tu bacteria.

¿Y no podría incorporar ese fragmento de DNA que quiero donarle a mi bacteria en el mismo plásmido en el que incorporo la capacidad de recombinación?

Plásmido X = Hfr + gen celulolítico

Vamos que tendrías que transformar la bacteria dos veces.

Pero vamos a probar con un fago. Un fago que infecte tu bacteria. Y que además sea de los que insertan el ADN en el cromosoma bacteriano. ¿Dónde se va a insertar? Buena pregunta. ¿Y si se carga la bacteria sólo con eso porque se inserta en un sitio crucial?

Da igual, en alguna se insertará en un buen sitio para que la bacteria sobreviva. Vamos, que en una placa te crecerán tanto las bacterias infectadas como las que no lo están. ¿Cómo seleccionas las que lo están?

Exacto, podría suceder. Nuestra intención es, precisamente, inducir que esa doble recombinación se produzca justo en el punto en el que se encuentra el gen LacZ. Suceden dos cosas:
1- Logramos introducir nuestro gen.
2- Logramos un método selectivo: aquél que incorpore el gen tendrá el gen LacZ interrumpido y no podrá degradar la lactosa. Aquél que degrade la lactosa, será porque no habrá incorporado el gen celulolítico y no nos interesará.

¿Cómo lo hacemos? Regiones homólogas. Conociendo cuáles son las regiones de los extremos del gen LacZ (imagina que la situación es ACTAA - LacZ - CACTG), manipulamos el genoma de nuestro plásmido (Hfr + gen celulolítico) para que las secuencias contiguas y extremas a las del gen celulolítico sean TGATT y GTGAC. Nos quedaría, entonces, TGATT - Celulolítico - GTGAC, de modo que de producirse una doble recombinación (posible al ser cepa Hfr) nuestro gen celulolítico queda insertado en la región donde antes se encontraba el gen LacZ.

El LacZ está muy bien para bacterias Lac⁺... en un principio. Porque no se te va a insertar el fago ahí por mucho que tú quieras. A menos que lo hagas con un plásmido.

Es decir, que si quieres usar el LacZ de la bacteria, no vas a conseguir recombinar. Y si no recombina, vas a tener que usar un plásmido. Lo tienes jodido...

Arriba la posible respuesta. ¿A qué te refieres con "A menos que lo hagas con un plásmido"?

Consulta aparte: ¿conoces algún "lugar" (web, libro, revista científica,...) en el que se haga especial mención a la Nanotecnología y la Nanociencia? Son temas muy nuevos y me llaman muchísimo la atención, por lo que me gustaría aprender cómo están las cosas y orientarme un poquillo en el mundillo, porque creo que estoy interesado y que puede ser una de las salidas que quiera buscar tras finalizar la carrera ("aún" quedan 2 años).

[Khram Cuervo Errante]

¿Y no podría incorporar ese fragmento de DNA que quiero donarle a mi bacteria en el mismo plásmido en el que incorporo la capacidad de recombinación?

Plásmido X = Hfr + gen celulolítico

No, para que se produzca recombinación bacteriana necesitas lo siguiente:
EJEMPLO.

Célula E. coli Hfr⁺
Célula E. coli Hfr^+/-

Una de las dos introducirá su cromosoma completo en la otra, forzándola a recombinar en lugares homólogos. Podrías conseguir lo mismo con alguna otra enterobacteria cercana evolutivamente a E. coli. Pero necesariamente, la recombinación se ha de dar entre dos cromosomas. Si metes el plásmido Hfr te va a dar igual.

Exacto, podría suceder. Nuestra intención es, precisamente, inducir que esa doble recombinación se produzca justo en el punto en el que se encuentra el gen LacZ. Suceden dos cosas:
1- Logramos introducir nuestro gen.
2- Logramos un método selectivo: aquél que incorpore el gen tendrá el gen LacZ interrumpido y no podrá degradar la lactosa. Aquél que degrade la lactosa, será porque no habrá incorporado el gen celulolítico y no nos interesará.

El problema, y es el que creo que no te acabas de dar cuenta, es que ninguna bacteria que degrade lactosa en estado wild-type va a incorporar nada en su LacZ. La única forma de hacerlo sería que ese LacZ estuviera en un plásmido. Es decir que tu forma de hacerlo debería incluir:

1.- Un fago.
2.- Un plásmido con el LacZ.

¿No sería mejor ahorrarte el paso del fago?

El problema, tal como lo planteas es el siguiente. Tú quieres un fago insertivo o con capacidad insertiva o como quieras llamarlo que lleve un gen de tu interes (una celulasa) y que además se inserte en el LacZ de una bacteria que es LacZ⁺.

La dificultad de este método radica en lo siguiente. Una bacteria LacZ⁺ no va a tener ningún lugar de inserción para ningún fago en ese sitio. Los fagos no suelen incorporarse en genes constitutivos de las bacterias, con lo que tendrías que encontrar un gen inducible. Y las bacterias no poseen de estos excepto en plásmidos. El tratar de encontrar una secuencia que pudiera recombinar en ese LacZ seguramente dejaría inactiva la función insertiva del fago y el genoma del virus quedaría en la bacteria en forma de plásmido. Con lo que tienes un plásmido muy bonito, no inducible e inservible.

¿Cómo lo hacemos? Regiones homólogas. Conociendo cuáles son las regiones de los extremos del gen LacZ (imagina que la situación es ACTAA - LacZ - CACTG), manipulamos el genoma de nuestro plásmido (Hfr + gen celulolítico) para que las secuencias contiguas y extremas a las del gen celulolítico sean TGATT y GTGAC. Nos quedaría, entonces, TGATT - Celulolítico - GTGAC, de modo que de producirse una doble recombinación (posible al ser cepa Hfr) nuestro gen celulolítico queda insertado en la región donde antes se encontraba el gen LacZ.

Todo esto estaría muy bien, excepto por un pequeño problema. ¿Cómo sacas tu gen de la celulasa del plásmido Hfr? El Hfr provoca recombinación entre dos cromosomas homólogos, pero nunca entre un cromosoma y un plásmido.

Arriba la posible respuesta. ¿A qué te refieres con "A menos que lo hagas con un plásmido"?

Metes el LacZ en un plásmido y luego un fago para que se introduzca en ese LacZ, pero tendrías que usar una bacteria LacZ^-. Lactobacillus no serviría.

Trata de enfocarlo así: necesitas una bacteria que degrade celulosa. Yo intentaría hacerme con una cepa de E. coli que fuera deficiente en algún punto necesario de su metabolismo y complementarla con un plásmido que:

1.- complete ese punto de metabolismo. Imagina una bacteria incapaz de metabolizar glucosa, por ejemplo. Pues le metes un plásmido para que la metabolice.
2.- Junto a la glucohidrolasa le metes tu celulasa. Así, cuando la bacteria pueda "comer" va a producir tanto la glucohidrolasa como la celulasa. Esto te produce dos beneficios. El primero, que el plásmido no se va a perder en generaciones sucesivas. Y el segundo, que vas a tener tu celulasa produciendo a saco.

Consulta aparte: la verdad es que no tengo muchos conocimientos de ese campo y tampoco podría guiarte. No conozco más allá de lo que pueda haber en el JCR...

[Rohi]

Watta, cuando sales por la parte de arriba de la facultad (por donde estan las ingenierias) te encuentras de morros con el Institut Català de Nanotecnologia.

http://www.nanocat.org/

[Watta]

E.coli no nos sería útil: queremos hacer uso de bacterias que se encuentren en el duodeno en gran cantidad y que no puedan llegar a alterar el equilibrio de la biota intestinal, y por eso nos decidimos por el género Lactobacillus. Lo comentaré con los compañeros y a ver qué hacemos.

¿Qué es el JCR? En cuanto a nanocat.org, Rohi, tendré que pasarme por ahí

Gracias a ambos.

[Khram Cuervo Errante]

JCR: journal citation reports.

[TitoHarris]

y porqué no hay Lactobacillus que sean defectivos para la degradación de lactosa?? Has mirado en el CECT o en el Instituto Pasteur?

Podrían utilizar como fuente de carbono la histidina, por ejemplo.

Y si no existen, porque no se pueden hacer?

Le insertas un plásmido con los genes His + alguna resistencia (no betalactamica)
Seleccionas a los que llevan el inserto mediante crecimiento con la resistencia
Irradias (o les metes Bromuro de Etidio, Naranja de Acridina...) a los pobres Lactobacilus
Los haces crecer en medio con Lactosa y un betalactámico de manera que mates a todos los Lac+

Haces dobles siembras en medio Lac+ y en medio Lac- His+

y alguna habrá que sea defectiva para usar la Lactosa como fuente de carbono.

Por otra parte, la inoculación de las bacterias como la pensáis hacer?
Para evitar la degradación en el estómago, un supositorio no iría nada mal  

PD.: Watta estas haciendo Bio en la UAB?