El consultorio biomédico de Khram Cuervo Errante

[Rohi]

Khram, lo prometido es deuda A ver si puedes ayudarme.

Creo que más chungo que éste de PCR no nos va a salir... así si me pudieras explicar cómo hacerlo pues iría dabuten. Veo por aquí que tienen en cuenta la temperatura de annealing dependiendo de la secuencia, ponen algo como:
4xCG + 2xAT=TM

Tª = TM+5º --> [annealing] (50-60)

bueno, tú lo sabrás mejor, a ver si me salvas la vida

Para facilitar la purificación de una proteína recombinante se decide añadir una cola de Hsitidinas al N-terminal o al C-terminal de esta proteína. En el esquema adjunto se muestra la parte relevante de la secuencia de nucleotidos del gen que codifica por esta proteína.

Proponed un par de cebadores para una reacción de PCR que permita amplficar la secuencia codificante de este gen y añadir un codón de iniciación seguido de seis codones de Histidina en el N-terminal. Proponed también un par de cebadores que añadan seis codones de Hsitidina seguidos de un codón stop en el c-terminal.

[Khram Cuervo Errante]

El codón de His es CAC. Así:

CGT CGT ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT CTT GCT GCA AGT CTC TCT CAC CAC CAC

CAC CAC CAC TAG

Luego necesitas unos primers tal que:

gca gca tac cga tga gca - 18 nucleótidos de los que:

10 son GC y 8 AT. Por tanto, la TM son 56. Y la tª de Annealing son 61. Quita la última A y te quedan:

gca gca tac cga tga gc - 17 nucleótidos de los que:

10 son GC y 7 AT. TM = 54 ----> tª de annealing: 59ºC

Y por el otro lado necesitas:

gag aga gtg gtg gtg gtg gtg gtg atc - 27 nucleótidos de los que

16 son GC y 11 son AT. TM = 86 + 5 --------> tª de annealing: 91 ºC.

Así que hay que equilibrar la proporción GC/AT. Vamos a probar con el otro codón de H, que es CAT, por tanto:

gag aga gta gta gta gta gta gta atc - 27 nucleótidos. de los que

10 son GC y 17 son AT. TM = 74 + 5 ---------> tª de annealing: 79 ºC.

Aún nos pasamos, así que vamos a probar otra cosa. Vamos a usar los codones tras el paro, introduciendo una mutación. Así, en lugar de:

CGT CGT ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT CTT GCT GCA AGT CTC TCT CAC CAC CAC

CAC CAC CAC TAG

Vamos a usar:

CGT CGT ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT CTT GCT GCA AGT CTC TCT CAC CAC

CAC CAC CAC CAC TAG.

Así:

aga gtg gtg gtg gtg gtg gtg atc - 24 nucleótidos.

14 GC y 10 AT. TM = 76 ºC --------> tª = 81ºC.

En lugar de CAC vamos a usar CAT, pero OJO, el primer CAC tienes que mantenerlo, para que puedas introducir la mutación. Así:

aga gtg gta gta gta gta gta atc - 24 nucleótidos.

9 GC y 15 AC. TM = 66 ºC---------> tª = 71 ºC.

Aún vamos largos, pero menos. La única solución es reducir el número de nucleótidos del primer, pero si lo hacemos corremos el riesgo de perder el annealing. Así que a más no se puede llegar.

[Rohi]

Pero si el annealing es óptimo entre 50 y 60, por qué no hacemos un primer de 6 tripletes como en el N terminal sin introducir mutaciones ni nada?

[Khram Cuervo Errante]

Porque el ejercicio te pide expresamente que añadas una cola de 6 histidinas.

[Rohi]

Y hace falta que el primer coja toodas las histidinas? Con 6 tripletes no basta?

[TitoHarris]

10 min que me miro el ejercicio, y posteo la respuesta que nos dio Mrs. Teacher

[Khram Cuervo Errante]

Y hace falta que el primer coja toodas las histidinas? Con 6 tripletes no basta?

Vamos a ver, Rohi.

A tu secuencia tienes que meterle las 6 histidinas. Hasta aquí llegamos, ¿verdad? Si tu secuencia no las tiene, de alguna manera las tienes que meter. Y esa manera es el primer. No hay otra. Si el primer no tiene más que las 6 histidinas, ¿dónde está el codón de stop? Es decir, que tu primer tiene que incluir:

6 histidinas
1 codón de stop
al menos 1 codón para anillarse.

Esto, mutando el codón de stop que tiene tu secuencia, te deja con, como poco 24 nucleótidos. Si pruebas con los 24 nucleótidos y cuentas con la mutación tienes (he cambiado el último codón de stop, para quitarme una GC y dejar una AT):

aga gtg gta gta gta gta gta att

8 GC (32) y 16 AT (32) - TM = 64ºC y tª de annealing = 69ºC.

Esa es la menor temperatura que puedes conseguir con las condiciones que te da tu problema. Si quieres que tu proteína salga en condiciones, claro.

Y esto, es sólo pensando en el C terminal. Si quieres añadirlo al N terminal tienes que repetir la operación en el otro extremo, con la salvedad de que en el N terminal tienes dos codones que puedes mutar con cierta facilidad y usarlos para el annealing. En el C terminal no puedes porque el codón de paro no te sirve para el annealing.

[Rohi]

Ahora entiendo lo de las histidinas, estaba flipándolo. Lo que no me suena mucho que hayamos hecho es lo de inducir mutaciones

[Khram Cuervo Errante]

La mutagénesis dirigida es fácil de hacer. Basta con cambiar un codón concreto. Lo jodido es meterle las histidinas...

[TitoHarris]

la mutagénesis dirigida mediante PCR la hemso dado en teoría pero no hemos hecho problemas, bueno, aquí dejo el tostón para el N- terminal para que Krham nos vapulée y se ría de nuestra manera de hacer las cosas...



Copio más o menos íntegramente la solución del problema, en negrita pensamientos mios, que veo que las cosas no cuadran... 

A ver, lo que te piden es hacer dos cosas:

ATG- (HISx6)-Proteína-STOP

ó

ATG-Proteína-(HISx6)-STOP

Para ponerla en el N-terminal, tenemos la secuencia

ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT...

podemos hacer dos cosas

introducir las 6 histidinas (CAC) después del codón ATG

ó

introducir un codón ATG+6 (CAC) antes del ATG principal

Haciendo la primera opción, la cosa quedaría de la siguiente manera


ATG (x6 CAC) GCT ACT CGT CGC GCT GCT...

Para hacer el cebador con una TM rondando los 50-60 grados podemos cortar por dos sitios posibles...

ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT... (Hasta aquí)

Con lo cual nos daría una TM de ... 4xGC+2xAT = 4x11 + 2x6 = 56 ºC ( -5ºC) => 51ºC

Aquí lo que no entiendo es porqué se cuenta el primer ATG dentro del cebador, si realmente lo que tu tendrías es un ATG CACx6 de manera que el primer ATG no se uniría

ó la otra opción de cebador sería  la de cortar hasta...

ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT... (Hasta aquí) con una TM de 61ºC

El cebador ha de acabar en C ó G (cuantas más haya mejor) porque necesita un 3r enlace que le dé más velocidad de unión para que la polimerasa se acople mejor y no haya tanto movimiento.

Si haces la otra opción (la de añadir un ATG+ 6CAC + el ATG principal)

Puedes cortar por donde antes daba una TM de 61ºC pero le tendrás que restar 8ºC (del ATG que son 2+2+4) quedando la cosa así

Aquí no se le debe restar los 8 grados, era antes que se tenían que restar, no?

ATG x6CAC ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCT...

Además puedes hacer el cebador con intención de utilizar una enzima de restricción al principio (antes del ATG => CATATG) pero bueno, esto ya sería para sacar nota xD

Bueno, ahora solo hace falta diseñar el otro cebador ( el del C-terminal) complementario, hemos hecho el 5'->3' y ahora queremos el 3'->5' que lo escribo en sentido 5'->3'


5' CTT GCT GCA AGT CTC TCT TAG 3' GGG CCC (A)n

Podemos hacer dos cosas, si coger hasta...

5' CTT GCT GCA AGT CTC TCT TAG 3' hasta aquí, la TM nos queda 2x9+9x4=54 (-5) => 49ºC, un poco justo, así que obtaremos por la otra opción que sería cortar hasta...

5' CTT GCT GCA AGT CTC TCT TAG 3' este nos da una TM de 57ºC (son + 8 de 4+2+2)

Así que nos quedaremos con éste último (supongo que con el del N-terminal nos podemos quedar con el de 61ºC así no hay tanta diferencia entre 57 - 61)

y haciendo el complementario reverso la cosa quedaría de la siguiente manera:

5' (T)n GGG CCC CTA AGA GAG ACT....3'  OK?